Juan Pablo Luaces

La lesión cerebral hipóxico-isquémica es una gran causante de discapacidad neurológica a largo plazo, morbilidad y mortalidad a nivel global en adultos y niños. La disminución en el flujo sanguíneo tisular y de la concentración de oxígeno, consecuente a la lesión, da como resultado un suministro insuficiente de nutrientes al cerebro, reducción de energía disponible, aumento en la producción de radicales libres e inflamación. La asfixia perinatal (AP), la cual consiste en una suspensión del suministro de oxígeno antes, durante o inmediatamente después del nacimiento, causa lesión cerebral hipóxico-isquémica. Es unimportante factor de riesgo de daño en el desarrollo neurológico y su incidencia estimada es de 1/1.000 nacidos vivos en los países desarrollados. Esta tasa aumenta entre 5 y 10 veces en países en desarrollo. La AP se encuentra asociada a patologías como la esquizofrenia, la parálisis cerebral, la discapacidad cognitiva, la epilepsia, la ceguera y a otras enfermedades crónicas altamente incapacitantes. Sin embargo, hasta el momento no existe una terapia eficaz para neutralizar o reducir el daño inducido por la AP.

Los moduladores selectivos de receptores estrogénicos (MSRE) han demostrado ejercer efectos neuroprotectores en diferentes escenarios patológicos. Dichos efectos incluyen una disminución en las especies reactivas de oxígeno, la supervivencia mitocondrial y mantenimiento de la viabilidad celular, indicando que estos esteroides neuroactivos pueden consistir en moléculas prometedoras para mejorar la respuesta cerebral a lesiones.

Varios estudios proponen un modelo de privación de O2 y glucosa (POG) a fin de replicar estas condiciones. En este estudio, se sembraron células T98G en placas de 24 pocillos, 10.000 células/pocillo, en un medio de cultivo DMEM con 10% FBS, y fueron incubadas durante 2-3 días. Cuando se alcanzó la confluencia celular, se cambió el medio a DMEM libre de glucosa, y las células se incubaron en O2 al 1% en una incubadora de hipoxia (Cámara Hipóxica Incubadora, STEMCELL) durante 9 horas. Luego, la reperfusión fue impulsada por el cambio de medio a DMEM con alto contenido de glucosa suplementado con 10% de FBS y transfiriendo las células a 37°C en 95% O2/5% CO2. El grupo control se mantuvo en condiciones normales de O2 y glucosa durante todo el experimento. Para los tratamientos farmacológicos, los cultivos celulares se incubaron en medio DMEM libre de suero con Raloxifeno 10 y 100 nM, como cotratamiento de POG y reperfusión. La viabilidad celular y la morfología están estrechamente relacionadas. Como cambios morfológicos destacables se observó el aumento del estrés oxidativo, peroxidación lipídica y cambios enel potencial de membrana mitocondrial. La masa mitocondrial y el potencial de membrana y las especies reactivas de oxígeno se determinaron utilizando Nonil acridina anaranjada (NAO), éster metílico de tetrametil rodamina (TMRM), dihidroetidio (DHE) y 2’;7’Diacetato de diclorofluoresceína (DCFDA) respectivamente, por citometría de flujo e intensidad de fluorescencia. Después de los tratamientos, las células se cargaron en la oscuridad con NAO 5 μM a 37 ° C durante 20 minutos y se lavó con PBS para eliminar cualquier tinte no unido. Las imágenes DIC y de fluorescencia fueron adquiridas utilizando un microscopio NIKON - Eclipse Ti-E PFS, y la fluorescencia celular se analizó con Fiji. Se cargaron las microfotografías y se eliminaron las señales de fondo de las imágenes.

Con el uso de una cuadrícula numerada, se seleccionaron aleatoriamente 50 celdas en cada microfotografía. El valor medio de fluorescencia de las 50 celdas se determinó en 8 microfotografías para cada tratamiento utilizando el algoritmo de medición y seleccionando cada celda manualmente a través de RI (Regiones de Interés). No se hallaron variaciones en las condiciones de procesamiento de imágenes. Cada ensayo fue realizado con un mínimo de 6 pocillos replicados para cada condición y los experimentos se replicaron tres veces.

Se observaron cambios morfológicos como cuerpos celulares más pequeños y menor cantidad de procesos celulares después de POG en comparación con las células de control (Fig. 1). El raloxifeno preservó la morfología celular inclusive en  células POG/R. La exposición a POG/R redujo la viabilidad celular. Raloxifeno en 100 nM y en 10 nM mejoraron la supervivencia celular (65,34% y 70,56%) respectivamente en comparación con los grupos control. El potencial de membrana mitocondrial se halló conservado en un 58,9 % con tratamiento de raloxifeno 10 nM y en un 81,57% de cotratamiento con raloxifeno 100 nM. El cotratamiento con raloxifeno redujo la producción de superóxido en un 72,72%, y la producción de peróxido en un 57%. La masa mitocondrial fue preservada un 47,4%, 75,5% y 89% en células T98G expuestas a una privación de oxígeno y glucosa de 6 horas seguida de 3, 6 y 9 horas de reoxigenación, respectivamente (Fig. 2). El tratamiento con raloxifeno mejoró la supervivencia celular y potencial de membrana mitocondrial, y redujo la peroxidación lipídica y la producción de las especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que sugiere un efecto directo sobre las mitocondrias. En conclusión, estos hallazgos sugieren que los astrocitos podrían participar en los efectos protectores del raloxifeno en la lesión cerebral hipóxico-isquémica.

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El raloxifeno disminuye la muerte celular inducida por POG. A) Las células T98G se trataron con diferentes concentraciones de raloxifeno durante 6 h de POGy 3 h de reoxigenación, y la viabilidad celular fue evaluada mediante la prueba MTT. Los datos se representan como la media ± SEM de 4 experimentos independientes. Control (101,99 ± 1,85); POG/R (52,59 ± 2,02); POG/R + raloxifeno 100 nM (65,34 ± 2,03); POG/R+ raloxifeno 10 nM (70,56 ± 2,36) *P<0.005. B-D) El raloxifeno disminuye las alteraciones morfológicas inducidas por privación/reoxigenación de oxígeno-glucosa. Las microfotografías representan la morfología de las células expuestas a B) DMEM, C) POG/R y D) POG/R + Ral 100 nM. Escala 50 µm

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El raloxifeno preserva la masa mitocondrial en células T98G expuestas a 6 horas de POG y 3 horas de reoxigenación. La Figura muestra la masa mitocondrial en células T98G expuestas a 6 horas de privación de oxígeno-glucosa (POG) a 3 h (A-D), 6 h (E-H) y 9 h (I-L) de reoxigenación.